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常见的荧光定量PCR检测方法有哪些?

更新时间:2023-04-04      点击次数:1736
实时荧光定量PCR,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常见的荧光定量PCR检测方法有SYBR Green I荧光嵌合法和荧光探针法。

SYBR Green I荧光嵌合法:
SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后, 荧光大大增强。因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm,发射波长最大约为 520nm。PCR 扩增程序一般为 94℃~55℃~72℃三步法,40 个循环。SYBR Green I 的缺点:由于 SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
 
SYBR Green I 的优点:SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。

荧光探针法:
探针法通常是使用5’端带有荧光物质(如:FAM等),3’端带有淬灭物质(如:TAMRA、Eclipse、BHQ等)的探针进行荧光检测的方法。当探针完整时,5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约,不能检出荧光。探针的报告基团的发射波长要在淬灭基团的吸收波长范围内。

能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多,各有优缺点,必须根据具体的实验用途进行选择。如果用于区别同源性高的序列以及进行SNP分型解析等多重PCR检测,推荐用荧光探针法,而进行除此之外的Real Time PCR实验,我们推荐使用简单易行、成本低的SYBR Green I荧光嵌合法。
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