荧光定量PCR分析仪在基因表达分析中的应用

荧光定量PCR分析仪（qPCR仪）凭借其高灵敏度、高特异性和实时监测能力，已成为分子生物学领域的关键技术，在基因表达分析方面具有重要应用。

qPCR通过检测目标基因在mRNA水平上的表达量，结合内参基因（如GAPDH、β-actin）进行标准化，消除样本间RNA提取效率、逆转录效率等差异，实现基因表达的相对定量。

差异表达分析：比较不同处理条件（如药物处理、环境刺激）或不同发育阶段（如胚胎发育、细胞分化）下目标基因的表达变化。例如，研究炎症因子在巨噬细胞激活前后的表达差异。
疾病机制研究：通过检测肿瘤组织与正常组织中癌基因（如EGFR、HER2）或抑癌基因（如p53）的表达量，揭示肿瘤发生发展的分子机制。
药物作用机制：分析药物处理后细胞中特定基因（如凋亡相关基因Bax、Bcl-2）的表达变化，评估药物疗效及作用靶点。

 

实验流程：从样本处理到数据获取的关键步骤

样本采集与处理
组织/细胞样本：迅速裂解细胞或组织，提取总RNA（需避免RNA降解，可使用RNase抑制剂）。
血液样本：分离外周血单核细胞（PBMC）或血浆，检测循环肿瘤细胞（CTC）或循环游离DNA（cfDNA）中的基因表达。
逆转录（RT）
将mRNA逆转录为cDNA，使用随机引物或基因特异性引物。逆转录效率需通过内参基因验证，确保cDNA质量。
qPCR反应体系配置
引物与探针设计：引物需跨越内含子（避免基因组DNA污染），探针需与目标序列完全匹配。可通过NCBI Primer-Blast或OligoArchitect等工具设计。
反应条件优化：调整退火温度、Mg²⁺浓度、引物浓度等参数，确保扩增效率在90%-110%之间（通过标准曲线斜率计算）。
上机运行与数据采集
使用96孔或384孔板，设置阴性对照（无模板对照，NTC）和阳性对照。运行程序包括预变性、循环扩增（40-50个循环）和熔解曲线分析（SYBR Green法）。